Ночь на трассе 128

Kary B. Mullis. Перевод: Алексей Торгашев.

«Полимеразная цепная реакция» — эти слова теперь включены в толковый словарь Merriam Webster, а если вы зададите «PCR» в поиске Google, то получите 18 000 000 результатов (на конец 2017-го — уже 69,5 млн. — PCR.ru). Если же вы наберете «песня PCR», то получите миленькую композицию от Bio-Rad, которая будет завывать в вашем мозгу, как безумный кот в вашем гараже. Попробуйте.

Я набрел на PCR весной 1983 года, пытаясь увеличить спрос на олигонуклеотиды, которые до автоматизации моя лаборатория делала вручную. Наша новая машина от моего друга Рона Кука из Biosearch (на другом берегу залива Сан-Франциско) угрожала безработицей сотрудникам нашей лаборатории, выполняя за восемь часов то, что занимало у нас около трех недель. И делала это каждые восемь часов без перерывов.

Моя попытка удалась. Спрос увеличился примерно в миллион раз, и мне не пришлось увольнять никого из своих коллег по лаборатории Cetus.

Я ехал вверх по длинной петляющей дороге между Кловердейлом и Бонвиллем в округе Мендосино, направляясь на дачу. Моя девушка спала, я был функционально трезв (иначе дорога доказала бы обратное), но был поздний вечер, и я чувствовал себя странно. Странные вещи случались со мной на трассе 128 и раньше. Незаметные старики в... что это было? Серый халат. На том поле. Я ничего не видел. Или потерялся во времени: отчетливое ощущение, которое разделяла моя бывшая жена на дороге в Бонвилль, вспоминая, что мы только что покинули Кловердейл, который теперь в тридцати пяти милях к юго-востоку. «Где мы были?» — «Я не знаю; похоже, мы только что были в Кловердейле». Такая это была дорога, но сегодня вечером в середине этого участка на отметке в 46,58 миль вся моя последующая жизнь должна была полностью измениться всего за несколько минут.

Олигонуклеотиды — удивительные маленькие штучки, но, используя только их, невозможно определить, где физически на ДНК человека расположены конкретные точки. Если бы геном человека был организован случайным образом, по 17-нуклеотидному олигомеру однозначно определялась бы его позиция среди 6–7 миллиардов оснований на денатурированной ДНК. Но геном не беспорядочен, и любой 17-мер, который там есть, вероятно, присутствует в нем более одного раза, или, по крайней мере, там есть его несколько отличающаяся версия. Не существовало никакого способа в начале 80-х узнать об этом наверняка, и есть более сложные аргументы, почему это должно быть так, но если вы смотрели на гели полной ДНК человека, разбитой на рестрикционные фрагменты, гибридизованные с 20-мерами, вы видели множество мазков. Нет четких полос, как у рестрикционных фрагментов ДНК бактериофага, которые вы можете использовать в качестве маркеров. Те-то были четкими. Таким образом, если вы хотели изучать последовательность ДНК человека, вы должны были клонировать ее. Разрезать ДНК на куски по несколько тысяч пар оснований, изолировать каждый из них, вырастить в отдельной колонии бактерий, выяснить, какая колония содержит ваш любимый кусок, вытащить ее из чашки и вырастить отдельно. Это была магия клонирования, и это была магия. Мы все это знали. Даже уборщики, двигающие полотеры по лабораториям в ночи, могли это чувствовать.

Никто не знал в точности, что впереди. В конце семидесятых, как раз когда я начал работать на Cetus, ряд видных молекулярных биологов убедил остальных в этой области немного притормозить, чтобы подумать о безопасности. Созывали конференции, даже приняли законы в Кембридже, штат Массачусетс и Беркли, штат Калифорния. Мы были в безопасности в Эмервилле, где были игорные дома, но законов было немного. Никто не мог быть уверен, что помещение человеческих генов в микроорганизмы, способные заражать людей, — такая уж хорошая идея. Никто так и не выяснил этого, но сошлись на компромиссе: считать некоторые штаммы E. coli менее катастрофически разрушительными для людей, чем другие, и мы согласились использовать только их.

E. coli K12 не решал моей проблемы с новой машиной для синтеза нуклеотидов, так же как не решал он и проблемы быстрого определения нежелательной мутации в ДНК растущего плода, чтобы дать родителям возможность выбрать аборт.

Бессознательно сочетая две проблемы, я начал разрабатывать методы, в которых олигонуклеотиды могли бы использоваться для определения мутаций единичных пар оснований в цельной ДНК человека. Беременные не должны ждать клонирования, а результаты прогонки гелей и использования радиоактивных зондов на геномной ДНК были неоднозначными по причинам, упомянутым выше. Неоднозначность — не самая комфортная основа для принятия решения о жизни или смерти. Кто-то должен был придумать способ сконцентрировать единственный локус ДНК в присутствии миллионов подобных, но иных локусов, и без неизбежной задержки на клонирование.

Это случится сегодня вечером. И этим «кем-то» буду я. Через десять лет в Стокгольме я буду говорить тосты за здоровье шведской королевской семьи, улыбаясь от уха до уха своей удаче.

Калифорнийские каштаны вздрагивали тяжелыми цветами над трассой 128. Розовые и белые свечки, попадающие в свет моих фар, выглядели холодными, но они были наполнены теплыми ароматами, доминировавшими в пространстве запахов. Это, несомненно, была ночь каштанов, но что-то еще было подмешано в нее.

Передние колеса моей маленькой серебристой хонды тянули нас через горы. Мои руки чувствовали дорогу и повороты. Мое сознание пропутешествовало обратно в лабораторию. Цепи ДНК скручивались и дрейфовали передо мной. Пылающие синие и розовые образы удивительных молекул всплывали между горной дорогой и моими глазами.   

Я вижу свет фар на деревьях, но большая часть меня наблюдает за тем, как раскрывается нечто иное.

Если бы некто попробовал нарастить синтетический нуклеотид, комплементарный мишени на человеческой ДНК, всего на одно основание, используя ДНК-полимеразу и дидезоксинуклеозидтрифосфаты, в четырех разных пробирках, каждая из которых содержит все четыре основания, но только одно из них — меченое радиоактивным изотопом ³²Р, этот оптимистичный некто мог бы идентифицировать нуклеотид ДНК-мишени на три-штрих конце олигомера. Дидезоксисеквенирование так и работает… но… Огромное но… оно работает только на клонированных ДНК, где соотношение ДНК-мишени к нецелевой ДНК увеличено в миллион раз. К счастью для меня, я думал о других вещах, которые могли пойти не так, а не о суровой невозможности задействовать только верную последовательность. Я уделил достаточно внимания этой гипотетической проблеме, запланировав использование двух олигонуклеотидов, по одному на каждую цепь последовательности-мишени, подводящих к искомой паре оснований с обеих сторон. Хотя эти две стороны могут быть далеки в денатурированной реакционной смеси, они все равно будут представлять собой комплементарные нити, и если одна скажет мне, что «Т» находится на три-штрих конце одного олига, то другая должна сообщить, что на три-штрих конце другого находится «А». Небогато для контроля, но мне было нужно избавиться от олигов. По факту я этим и занимался. У нас был избыток олигов на руках.

Меня беспокоила еще одна проблема. Что если образец ДНК из ткани человека загрязнен собственными дезоксинуклеозидтрифосфатами? Не особенно маловероятно, и печальный факт заключается в том, что ДНК-полимераза не очень-то любит дидезоксинуклеотиды, если вокруг есть натуральный субстрат. Очень возможно, что она добавит несколько дезоксинуклеотидов к предложенному олигомеру, прежде чем приступит к дидезокси, меченым или нет. Это уничтожило бы ту простоту, на которую я надеялся, — тест, который мог бы быть завершен за одну смену в больничной лаборатории. Поэтому я стал думать о способах избавиться от примесей нуклеотидов в образце перед экспериментом.

По крайней мере три неверных представления подводили меня к PCR. Я был очень близок, но я не знал, к чему я был близок. Я ошибочно полагал, что просто решаю небольшую техническую задачу. Ну хорошо. Я не догадывался. Я не думаю, что нормальные люди могут прямо взглянуть на то, что будет иметь на них огромное влияние. Мы лучше подберемся сбоку.

Мое второе заблуждение состояло вот в чем: я считал, что процедура, которую я планирую, будет вообще работать. Против этого были вероятные проблемы с образцом, которые PCR вскорости разрешит. Я ехал дальше.

Третье заблуждение было более тонким и разделялось моими коллегами. Существует фермент, который мог бы удалить гипотетические блуждающие дезоксинуклеозидтрифосфаты, — бактериальная щелочная фосфатаза. Он мгновенно отстегнул бы их маленькие трифосфатные хвосты, но тогда мне пришлось бы избавиться от него, прежде чем я добавлю свои драгоценные дидезокси, или он отстегнет и их хвосты тоже. Все знали, что BAP, как мы его называли, невозможно необратимо денатурировать нагревом, поэтому вы не можете легко избавиться от него. Было известно об открытии естественной ренатурации BAP после тепловой денатурации. Установлено, что трехмерная структура белка восстанавливается на основе его аминокислотной последовательности. На рынке был продукт под названием MAT-BAP, чтобы избавляться от BAP, когда тот больше не желателен в реакции, присоединяя белок к нерастворимой матрице. У меня никогда ничего не получалось с этим продуктом, и ни я, ни кто-либо другой в этой области не осознавали, что, если вы возьмете микролитр BAP из коммерческой поставки и быстро его используете, — прежде чем он отдаст свой атом цинка в буфер, не содержащий цинка, — он будет некоторое время работать, а затем станет доступен для необратимой тепловой денатурации. Я обнаружил это намного позже, но, к счастью, в то время этого не знал. Известный эксперимент по рефолдингу проводили в буфере с высоким содержанием цинка.

Поэтому я рассмотрел другие способы избавиться от дезоксинуклеозидтрифосфатов.
Кленов! Он будет их полимеризовать, если дать затравку-олигомер и одноцепочечную ДНК-матрицу. Кленов был полимеразой, которую я планировал использовать в любом случае. Как умно. Я использую его дважды для двух целей. Сначала я денатурирую мой образец, поделенный на четыре пробирки, добавлю праймеры, которые я позже использую в главном событии, доведу до 37 градусов и подожду. Полимераза должна полимеризовать все нуклеотиды.

Теперь я нагрею смесь, чтобы удалить олиги, которые могли вырасти неопределенно длинными, охлажу до 37 градусов, добавлю еще полимеразы к той, что могла денатурироваться, и добавлю дидезоксинуклеотиды. У меня появилась она... PCR, но я еще не видел этого.

Будет огромный избыток олигомеров, свеженькие будут приземляться теперь на нити-мишени и, надеюсь, будут нарастать на один радиоактивный нуклеотид. Что могло пойти не так? Что делать, если олигомеры на стадии «избавиться от трифосфатов» удлинились значительно?

Я очень быстро остановил хонду на обочине, впрочем, торчком, подставив под потенциальные лесовозы. Со мной внутри, моей все еще спящей девушкой и моим новым изобретением в опасности я размышлял, что произойдет, если они будут удлиняться значительно. Их длинные продукты будут праймироваться другими олигами, а те также будут расти.

Я удвою сигнал, и я могу делать это снова и снова, и я могу добавить огромный избыток моих собственных дезоксинуклеозидтрифосфатов, поскольку они дешевы, растворимы в воде и легальны в Калифорнии.

Лучше мне убраться с дороги.

В нескольких сотнях ярдов ниже по 128-й был съезд. К тому времени, как я добрался туда, все основательно встало на свои места. Я могу задать олиги на некотором расстоянии друг от друга. После трех циклов они создадут двухцепочечную молекулу ДНК, точно соответствующую ДНК-матрице между ними, и ее концентрация будет удваиваться в каждом цикле. Что бы еще ни происходило, это не имеет значения. После десяти циклов у меня будет тысяча. Я понимал свою суперсилу удвоений, поскольку писал компьютерные программы и знал силу повторных циклов. Тридцать циклов дадут где-то около миллиарда. Продукт задавит все постороннее, потому что он будет автокаталитическим, и только сайт интереса свяжет два нужных олига в их маленьком репродуктивном танце.

Я не спал той ночью. На следующее утро я купил две бутылки пино-нуар виноградников Наварро, а к середине дня свалился в глубокий сон. Диаграммы реакций PCR были на каждой поверхности, на которой можно было писать карандашом или мелом. Проснулся я в новом мире.