Быстро и специфично выявить единичные бактерии Mycobacterium tuberculosis в образце

Подготовил Алексей Торгашев

На сегодня принято два надежных способа выявления возбудителей туберкулеза в образцах. Первый, до сих пор считающийся золотым стандартом, — бактериологическое исследование с посевом мокроты и дальнейшей микроскопией. Метод долгий, занимает до двух месяцев, поскольку микобатерии растут на средах исключительно медленно. Второй способ — амплификация ДНК микобактерий. Исследование быстрое, но относительно затратное.

Разработчики ищут недорогой и быстрый метод выявления патогенных микобактерий, результаты одной из перспективных разработок представлены в свежей статье в Science Translational Medicine.

Авторы создали флуоресцентную метку CDG-DNB3, которая срабатывает при наличии у бактерий двух ферментов: бета-лактамазы (BlaC) и белка DprE1. Молекулы первого фермента находятся в пептидогликановом слое клеточной стенки и служат для защиты бактерий от бета-лактамных антибиотиков. Второй фермент локализован в периплазме, между клеточной стенкой и плазматической мембраной, он необходим бактерии для производства компонентов клеточной стенки. Структура обоих белков высококонсервативна у клинических изолятов M. tuberculosis.

Молекула новой метки состоит из трех частей: мишени для бета-лактамазы, «якоря» для связывания с DprE1 и собственно флуорофора (см. схему на сайте журнала). В собранном виде конструкция не флуоресцирует, излучение флуорофора гасится частью молекулы, чувствительной к бета-лактамазе.

Мечение бактерий протекает по следующей схеме: молекулы метки проникают в пептидогликановый слой через каналы поринов, а там их встречают молекулы бета-лактамазы. BlaC расщепляют бета-лактамные кольца и освобождают флуорофоры, которые начинают флуоресцировать. Для того, чтобы флуорофоры не вымывались, а остались прикрепленными к бактериям, необходимы белки DprE1, с которыми флуорофоры ковалентно связываются через «якорь».

Исследователи опробовали конструкцию на образцах мокроты пациентов. Метка избирательно связывалась с M. tuberculosis и бациллами Кальметта — Герена (БЦЖ), причем только с живыми бактериями. Из 45 видов микобактерий, не вызывающих туберкулез, метка не связывалась с 43-мя, однако на два вида все же реагировала, что заставляет ученых говорить о необходимости дальнейшей модификации молекулы.

Чувствительность зонда оказалась очень высокой, он способен выявить единичные бактерии в образце. Более того, ученые опробовали автоматический подсчет бактерий с использованием микрофлюидных чипов для проточной цитометрии. Эксперимент дал отличный результат, позволяя определять бактерий в концентрации менее 100 КОЭ/мл. Стоимость даже экспериментального чипа — всего 65 центов, а все исследование длится около часа, посему авторы утверждают, что их метод найдет широкое применение как в исследовательских лабораториях, так и в клинической диагностике.

Источник

Yunfeng Cheng et al. // Rapid and specific labeling of single live Mycobacterium tuberculosis with a dual-targeting fluorogenic probe // Science Translational Medicine 15 Aug 2018, Vol. 10, Issue 454, eaar4470. DOI: 10.1126/scitranslmed.aar4470