Метагеномное секвенирование для диагностики РНК-вирусов в образцах крови

Подготовила Елена Клещенко

Метагеномное секвенирование широко используется в исследовании инфекционных агентов, диагностике и эпидемиологии. Стивен Пуллен, руководитель проекта по геномике группы редких и новых человеческих патогенов в Public Health England (исполнительного органа департамента здравоохранения и соцобеспечения Великобритании), заявил, что протокол аналогичен стратегии метагеномного секвенирования для MinIon, описанной группой Чарльза Чиу (Калифорнийский университет в Сан-Франциско) в 2015 году. Авторы работы показали, что MinIon может идентифицировать патоген (вирус чикунгунья, лихорадки Эбола и гепатита С) в крови. Однако они исследовали всего несколько образцов с высокой вирусной нагрузкой, тогда как работа PHE была проведена на многих образцах с различными нагрузками. Как отмечает Пуллен, они стремились создать протокол, подходящий для полевой работы на месте вспышки заболевания, когда нет времени и условий для культивирования патогена.

Сотрудники PHE сфокусировались на РНК-вирусах лихорадки денге и чикунгунья, отчасти потому, что у них был доступ к образцам пациентов британской Лаборатории редких и импортных патогенов. Так, они исследовали 26 образцов, положительных по вирусам денге или чикунгунья. Одним из ключевых этапов протокола Пуллен назвал деградацию ДНК после экстракции нуклеиновых кислот, — удаление ДНК облегчает идентификацию РНК-вируса. После этого команда подготовила кДНК с использованием стратегии сиквенс-независимой амплификации (аналогичной той, что была описана командой Чиу), а затем выполнялись случайная обратная транскрипция и секвенирование.

«Настоящим сюрпризом для нас была высокая доля вирусных ридов», — сказал Пуллен и добавил, что причина, скорее всего, в деградации ДНК. Обычно целевые риды составляют крохотную долю от всех. Другая британская команда, которая использует MinIon для диагностики туберкулеза на Мадагаскаре, обнаружила, что сделать это сложно именно из-за высокого фона ДНК человека. Но в случае РНК-вирусов ДНК-фон легко можно исключить.

Примечательно, что хотя секвенирование на Illumina давало больший процент ридов из вирусных геномов, секвенирование с 20-кратным покрытием на MinIon обеспечило аналогичное покрытие генома: например, даже в образце с вирусом чикунгунья, для которого получили самый низкий процент вирусных чтений (5% на MinIon и 22% на MiSeq), при 20-кратном покрытии с MinIon было просеквенировано более 89% генома.

В целом, сказал Пуллан, как MinIon, так и MiSeq позволяли идентифицировать вирус и получить последовательность большей части вирусного генома. Кроме того, исследователи определили в одном из образцов коинфекцию вирусами чикунгунья и денге. Хотя только 0,08% ридов MiSeq и 0,15% ридов от MinIon соответствовали геному вируса денге, 20-кратное секвенирование на MinIon охватило как первичный вирус чикунгунья, так и вирусы денге более чем на 99% и 95% соответственно.

Во время исследования Oxford Nanopore выпустил два новых комплекта для подготовки библиотек — комплект 1D ²  и быстрый комплект, — которые также испытали сотрудники PHE. Хотя при использовании обоих комплектов доля вирусных ридов снизилась, 1D² увеличил объем данных до 5 миллионов чтений (при 1,8 миллиона у 2D, т.е. секвенировании обеих нитей). Преимущество Rapid Sequencing Kit от Oxford Nanopore — ускоренная и упрощенная подготовка образца всего за 10 минут.

По словам Пуллена, команда планирует продолжить тестирование различных метагеномных протоколов, чтобы выяснить, какие технологии лучше подходят для тех или иных приложений. Сейчас они уделяют основное внимание протоколам для полевой работы, для отслеживания вспышек эпидемий в режиме реального времени, но также будет рассмотрен вопрос о разработке диагностического теста на вирусы денге или чикунгунья. Кроме того, группа участвует в проектах по разработке метагеномных диагностических анализов на грипп из респираторных образцов.

Источники

Public Health England Team Describes Metagenomic Sequencing Strategy to ID Viral Pathogens

Liana E Kafetzopoulou et al. // Assessment of Metagenomic MinION and Illumina sequencing as an approach for the recovery of whole genome sequences of chikungunya and dengue viruses directly from clinical samples. // BioRxiv 2018 DOI: 10.1101/355560