Найден новый класс антибиотиков природного происхождения

Неизвестных науке бактерий намного больше, чем известных: лишь малая доля микроорганизмов «соглашается» расти в лаборатории, на готовых средах, а все прочие до недавнего времени оставались неизученными. Однако современные методы анализа ДНК изменили ситуацию. Сегодня микроорганизмы не обязательно культивировать — можно начинать изучение биоразнообразия непосредственно в пробах. Такие исследования имеют большую прикладную значимость: бактериальная «темная материя» — потенциальный источник новых антибиотиков.

Перспективными для борьбы против инфекций с множественной лекарственной устойчивостью представляются кальций-зависимые антибиотики — небольшое семейство N-ацилированных циклических пептидов, которые для антибактериальной активности нуждаются в кальции. Они содержат консервативный мотив Asp-X-Asp-Gly, который, как считается, облегчает связывание кальция. К этому семейству принадлежит, например, даптомицин — его назначают при лекарственно-устойчивой бактериемии и других осложненных инфекциях.

Исследователи из Рокфеллеровского университета под руководством Шона Брэди искали в метагеномах образцов из окружающей среды такие гены, которые могут быть вовлечены в синтез кальций-зависимых антибиотиков. «Хотя методы обнаружения антибиотиков на основе метагенома все еще находятся в зачаточном состоянии, масштабирование и автоматизация описанной здесь методологии должны сделать возможным систематическое нахождение в глобальном метагеноме [природных] антибиотиков, которые до сих пор оставались скрытыми», — говорится в статье, опубликованной 12 февраля в Nature Microbiology.

Шон Брэди и его коллеги выделили ДНК из 2000 уникальных образцов почвы, собранных практически со всей территории США. Для амплификации они использовали вырожденные ПЦР-праймеры, ориентированные на консервативные области генов, продукты которых обеспечивают синтез кальций-зависимых антибиотиков. В частности, они планировали найти аденилирующие домены (отвечающие за присоединение АМФ к белкам) нерибосомных пептидсинтетаз. Полученные ампликоны проанализировали с помощью биоинформатической платформы Environmental Surveyor of Natural PRODUCTS Diversity (eSNaPD).

Три четверти почвенных проб содержали метки, которые соответствовали по меньшей мере одному известному домену аденилирования. Это сколько же потенциальных антибиотиков! (Рис. в статье.) 

Затем авторы работы построили филогенетическое древо, основанное на обнаруженных последовательностях домена аденилирования, и увидели клады («ветви» дерева), обособленные от известных последовательностей. Можно было предположить, что эти гены принадлежат продуцентам других кальций-зависимых антибиотиков, пока еще не охарактеризованных. Один перспективный вариант обнаруживался в 19% метагеномов — то есть очень многие почвенные бактерии синтезируют некое неизвестное нам семейство антибиотиков. Эти антибиотики действительно были открыты и получили название «малацидины» (metagenomic acidic lipopeptide antibiotic-cidins).

Чтобы доказать существование малацидинов, прежде всего надо было собрать из фрагментов ДНК полный кластер генов, продукты которых отвечают за биосинтез антибиотика. Авторы работы нашли фрагменты этого кластера в библиотеке, собрали их в дрожжевой клетке с использованием метода TAR (transformation-associated recombination) и получили искусственную бактериальную хромосому, несущую полный кластер, которую внедрили в клетку Streptomyces albus. И действительно, S. albus стал производить антибиотик — экстракт его культуры подавлял развитие золотистого стафилококка и содержал метаболиты, которые были названы малацидинами А и В.

Структуру этих соединений установили с помощью масс-спектрометрии и ЯМР-анализа. Малацидины представляют собой 10-членные циклические липопептиды. Интересно, что хотя кальций им необходим для антибактериальной активности, у них нет канонических кальций-связывающих доменов.

Малацидины оказались активными против грамположительных бактерий, в том числе патогенов с множественной устойчивостью. В экспериментах на крысах авторы работы обнаружили, что местное применение малацидина А обеззараживает рану, инфицированную метициллинрезистентным Staphylococcus aureus. Они также попытались вызвать у стафилококка резистентность к малацидину, подвергая его сублетальным уровням антибиотика. Но даже через 20 дней резистентности не наблюдалось.

Известно, что другие кальций-зависимые антибиотики влияют на синтез липидной мембраны или клеточной стенки бактерий. Однако малацидины не нарушают целостность мембраны — по-видимому, они повреждают клеточную стенку иным способом.

Современные технологии не в первый раз демонстрируют свои возможности в поиске новых антибиотиков. В 2015 году сотрудники компании Novobiotic Pharmaceuticals нашли почвенную бактерию, которая синтезировала антибиотик теиксобактин (Losee L. Ling et al. // A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. // Nature, 2015, 517, 455—459, DOI: 10.1038/nature14098). Это была первая такая находка за много лет; предыдущий микроорганизм — производитель антибиотика был обнаружен в природе еще в 80-е годы ХХ века. Бактерии дали предварительное название Eleftheria terrae (оно отражает нежелание этого вольного существа расти в культуре: «элефтерия» по-гречески означает «свобода»). Изолировать ее позволила остроумная разработка исследователей из Северо-Западного университета — iChip, от isolation chip technique: пластиковый блок с лунками, заполненными питательной средой, в который вносится раствор образца с таким расчетом, чтобы в каждой лунке оказалось не более одной бактерии. Затем чип затягивают полупроницаемой мембраной и помещают обратно в почву. Все вещества, которых нет в готовой среде, но которые необходимы бактерии, попадают в лунку через мембрану, таким образом проблему некультивируемости удается решить. Изучение теиксобактина сейчас продолжается, пытаются, например, получить его синтетические аналоги. 

А в 2016 году бактерию — продуцента антибиотика обнаружили в микробиоме человеческого носа (Zipperer A. et al. // Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. // Nature, 2016, 535, 511—516, DOI:10.1038/nature18634). Ничего странного в этом нет: в нашем организме обитает множество микроорганизмов, и они так же конкурируют друг с другом и применяют против конкурентов «химическое оружие», как и обитатели почвы.

Источники

Bradley M. Hover et al. // Culture-independent discovery of the malacidins as calcium-dependent antibiotics with activity against multidrug-resistant Gram-positive pathogens. // Nature Microbiology (2018). DOI: 10.1038/s41564-018-0110-1

https://www.genomeweb.com/genetic-research/search-soil-microbiome-turns-new-class-antibiotics-called-malacidins