Новая технология расширит генетический код бактерий и эукариот

Подготовил Александр Колесников

Сайт-направленная модификация белков неканоническими аминокислотами открыла огромные возможности для изучения поведения макромолекул in vivo. С ее помощью можно, к примеру, вводить в белок, находящийся в живой клетке, флуоресцентную или иную метку либо пришивать белок к другому белку или иной макромолекуле строго определенным образом. Неудивительно, что спрос на возможность специфически модифицировать различные (а в идеале все имеющиеся) аминокислоты, весьма высок.

Включение неканонической аминокислоты в белковую молекулу обеспечивает искусственно модифицированная аминоацил-тРНК-синтетаза. Этот фермент работает в паре с супрессорной тРНК, которая распознает, как правило, амбер-кодон UAG, искусственно введенный в последовательность белка-мишени. В норме данный кодон отвечает за терминацию трансляции, однако при введении в клетку ДНК, кодирующей пару «супрессорная тРНК – тРНК-синтетаза», вместо терминации происходит включение неканонического аминокислотного остатка.

До сих пор исследователи главным образом работали с двумя тРНК-синтетазами из архебактерий, не имевшими аналогов в E. coli. Однако они в большинстве случаев были непригодны для использования в эукариотах. Чтобы «обучить» синтетазу включению различных неканонических аминокислот, ее необходимо подвергнуть искусственной эволюции в E. coli. Ключевая проблема здесь — отсутствие системы, в которой бактерия сохраняла бы жизнеспособность и при этом обеспечивала бы возможность направленной эволюции тРНК-синтетазы, включающей ту или иную неканоническую аминокислоту и пригодной для использования в эукариотах.

Исследователи из Бостонского колледжа смогли создать такую систему, заменив в E. coli ее собственную тирозиновую тРНК-синтетазу на тирозиновую синтетазу архебактерии. Задача оказалась технически нетривиальной, но в итоге включать неканонические аминокислоты в белки «научились» собственные тРНК-синтетазы кишечной палочки, которые являются биоортогональными для эукариот. Построенный алгоритм замены и последующей направленной эволюции синтетаз оказался очень эффективным. Исследователи ожидали значительных трудностей при замене пары «тРНК-синтетаза», однако это удалось сделать. Теперь можно говорить о разработке полномасштабной технологии для введения различных неканонических аминокислот в белки эукариот.

Данный результат поможет значительно расширить знания о функционировании белковых молекул в клетках. Прикрепить флуоресцентный или иной маячок к белковой молекуле в живой клетке методами традиционной белковой химии невозможно: включение зонда будет неспецифическим, он попадет в различные белки, а также может инактивировать белок-мишень. Но если создать белок с неканонической аминокислотой в определенной позиции, а затем связать именно эту аминокислоту с оптической меткой, таких проблем не возникнет. Достижения «биоортогональной» химии, в частности, клик-химии, обеспечивают абсолютную селективность включения метки в модифицированный аминокислотный остаток.

Источник

Italia J. S. et al. //Resurrecting the Bacterial Tyrosyl-tRNA Synthetase/tRNA Pair for Expanding the Genetic Code of Both E. coli and Eukaryotes.// Cell Chemical Biology (2018), DOI: 10.1016/j.chembiol.2018.07.002