Иллюстрация: Alexandre Paix/ Johns Hopkins Medicine
Иллюстрация: Alexandre Paix/ Johns Hopkins Medicine
Подготовила Надежда Кузнецова
Технология CRISPR-Cas9 — отличный инструмент для редактирования генома. ГидРНК контролирует распознавание участка ДНК, в котором эндонуклеаза Cas9 сделает двухцепочечный разрыв. Для закрытия таких разрывов необходима донорная ДНК, которая заменяет удаленный участок, а затем благодаря гомологичной репарации происходит образование «заплатки». Однако синтезированная донорная ДНК встраивается в места двухцепочечных разрывов с низкой эффективностью, и это снижает возможности практического применения метода, особенно в медицине. Мутации, ассоциированные с болезнями, желательно исправлять во всех клетках, а не в некоторых.
Считалось, что донорная ДНК должна содержать обширные последовательности, гомологичные редактируемому участку, и это должна быть одноцепочечная или кольцевая ДНК, которую трудно получить в больших количествах. Группа ученых под руководством Джеральдин Седу (Geraldine Seydoux) показала, что это не обязательно, и сформулировала простые правила дизайна «генетической заплатки». Авторы работы редактировали с помощью CRISPR/Cas9 геномы почечных эмбриональных клеток человека, причем использовали разные варианты донорной ДНК. Вставка во всех случаях несла ген зеленого флуоресцентного белка, так что при успешном редактировании мембрана клетки начинала светиться зеленым.
Как установил Александр Пе (Alexandre Paix), один из участников работы, хорошая донорная ДНК должна иметь гомологичные целевому локусу плечи длиной около 35 нуклеотидов. Вероятность успеха в оптимальных условиях была такой же, как с плечами длиной более 500 нуклеотидов, но более короткие плечи, 15 и 16 нуклеотидов, снижали ее вдвое. Короткие участки встраиваются более успешно, чем длинные, тем не менее даже для вставки 993 нуклеотида удалось достичь 17,9%. Однако для вставок более 1000 нуклеотидов эффективность резко падает. «При этих размерах ввести необходимое для редактирования количество ДНК очень трудно, — говорит Джеральдин Седу. — Клетки как будто давятся таким обилием ДНК».
Александр Пе также обнаружил, что эффективность встраивания фрагментов линейной ДНК в клетках человека в пять раз выше по сравнению с кольцевой ДНК. А линейную ДНК несложно получить с помощью PCR. Кроме того, ученые выяснили, что редактируемый участок не должен был удален более чем на 30 нуклеотидов от места разрезания.
Синим обозначена донорская ДНК, зеленым — участок, подлежащий редактированию (EDIT), серым — редактируемая ДНК клетки, вертикальный пунктир — двунитевой разрез (DSB).
1. Редактируемый участок должен быть не дальше 30 нуклеотидов от DSB.
2. Оптимальная длина гомологичных плеч справа и слева — около 35 нуклеотидов.
3. По крайней мере проксимальный (примыкающий к DSB) гомологичный участок должен содержать минимум мутаций; если используется однонитевая донорная ДНК, проксимальный участок должен быть на ее 3’-конце.
4. Участок, помеченный звездочками, должен содержать сайленс-мутации, чтобы снизить в этом месте гомологию, повысить частоту редактирования в участке EDIT, а также для того, чтобы донорную ДНК не разрезала Cas9.
5. Для небольших исправлений, которые нельзя детектировать по размеру фрагмента, полезно добавить сайт рестрикции в EDIT или левее, в дистальном плече, чтобы облегчить детектирование вставки.
«Эти параметры должны подойти большинству ученых. Фактически в большей части экспериментов бывает нужно отредактировать только два или три нуклеотида рядом с сайтом CRISPR», — комментирует Седу.
Результаты оставались неизменными для вставок в трех разных участках генома. Опыты также успешно прошли на эмбрионах мышей, а в планах ученых — тестирование на других видах и других типах человеческих клеток.
Источник
Alexandre Paix et al. // Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks// Proc Natl Acad Sci U S A. Pudlished online 2017 Nov 28. pii: 201711979. DOI: 10.1073/pnas.1711979114.
Показать все 0 комментария