Тестовые полоски SHERLOCK. Слева направо: две неиспользованные, три отрицательных результата, два положительных. Credit: Zhang lab, Broad Institute of MIT and Harvard
Тестовые полоски SHERLOCK. Слева направо: две неиспользованные, три отрицательных результата, два положительных. Credit: Zhang lab, Broad Institute of MIT and Harvard
Технология CRISPR применима не только для редактирования генома. Возможность разрезать молекулу нуклеиновой кислоты в строго определенном месте имеет большой диагностический потенциал, и теперь создатели системы CRISPR-Cas соревнуются в создании высокотехнологичных тест-систем. Группа Дженнифер Дудны (Калифорнийский университет, Беркли) разработала систему, успешно различающую два близких штамма папилломавируса. А коллектив, который возглавляют исследователи из Института Брода и Массачусетского технологического института, создал модификацию системы SHERLOCK, первую версию которой представили научной общественности в апреле 2017 года. Кстати, многие работы в этом направлении были выполнены при участии Евгения Кунина.
Диагностическая система SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) напоминает тест на беременность — бумажная полоска, которую можно опустить в биологическую жидкость и по положению лиловых поперечных линий увидеть, обнаружена искомая молекула или нет. Метод не требует специального оборудования, подходит для полевых условий. Система совместима как с ДНК, так и с РНК.
В прошлом сезоне SHERLOCK успешно определял специфические штаммы вирусов Зика и денге, различал патогенных бактерий, генотипировал человеческую ДНК, идентифицировал мутации в опухолевой ДНК. В новой версии SHERLOCKv2 существенно увеличена чувствительность, появилась возможность оценивать количество молекулы-мишени, а также определять в образце сразу несколько разных молекул. Для демонстрации возможностей метода авторы определяли опухолевую ДНК в образцах крови при немелкоклеточном раке легких (очередной подход к популярной теме жидкой биопсии), а также находили синтетические вирусы Зика и денге одновременно в одном образце. И, возможно, самое эффектное — новая форма: стрип-полоска вместо флуоресцентной детекции.
«SHERLOCK обеспечивает недорогой, простой в использовании и чувствительный диагностический метод для обнаружения нуклеиновой кислоты — это может означать вирус, опухолевую ДНК и многие другие мишени, — сказал ведущий автор работы Фэн Чжан. — Улучшения SHERLOCK теперь позволяют получить еще больше диагностической информации и приближают нас к инструменту, который можно использовать в реальных ситуациях». Он добавил, что новая диагностика может найти применения также в промышленности и сельском хозяйстве.
Основа успеха SHERLOCK — CRISPR-ассоциированный белок Cas13. Как и в обычном CRISPR-Cas, гидРНК направляет Cas13 на определенный участок нуклеиновой кислоты. Целью может быть любая последовательность: вирусный геном, ген устойчивости к антибиотикам у бактерий, онкогенная мутация. Недостатком Cas13 считается неспецифическая активность, он может разрезать не только молекулу-мишень, но и другую РНК, находящуюся поблизости.
Эту нежелательную активность создатели SHERLOCK умело использовали. Если предложить комплексу CRISPR- Cas13 на съедение специально синтезированную РНК с флуоресцентной молекулой-репортером на одном конце и гасителем (quencher) на другом, то Cas13 сначала расщепит молекулу-мишень, потом эту сигнальную РНК, и при удалении от гасителя репортер начнет флуоресцировать.
Более того, в новой работе авторы сравнили ферменты семейств Cas13a и Cas13b, взятые у разных бактерий, и нашли такие, которые «предпочитают» определенные последовательности нуклеотидов и разрезают в основном их. Использовали также фермент Cas12a, ранее известный как Cpf1 (он расщепляет ДНК-репортер, а не РНК). Это позволило сделать четырехканальную мультиплексную детекцию — определять четыре участка ДНК или РНК в одном образце, с отдельным флуоресцентным сигналом для каждого, — а значит, для анализа нужно меньше времени и биоматериала. Что и было продемонстрировано на образцах с синтетическими вирусами Зика и денге (быстро различать их — важная задача, потому что симптомы у лихорадки Зика и лихорадки денге сходные).
Затем систему модифицировали для стандартных стрип-тестов. В этом случае репортерная молекула РНК на одном конце несет краситель ФАМ (флуоресцеинамидит), а на другом вместо гасителя — биотин. На полоске снизу вверх расположены зоны антител против ФАМ с наночастицами золота, затем стрептавидин, связывающий биотин, и белок А, который связывает антитела. Поднимаясь с раствором по полоске, репортерные молекулы, целые или разделенные пополам, задерживаются либо в одной, либо в другой зоне.
Как работают тест-полоски SHERLOCK. Если в пробе присутствует молекула-мишень, CRISPR- Cas13 расщепляет ее и заодно РНК-репортер с ФАМ на одном конце и биотином на другом. Когда раствор поднимается по полоске, ФАМ взаимодействует с антителами, несущими золотые наночастицы (антитела на рисунке не показаны), затем нерасщепленные репортерные молекулы и-или «биотиновые» половинки расщепленных связываются со стрептавидиновой зоной, а половинки с ФАМ и антителами образуют вторую полоску
Для усиления сигнала систему дополнили изотермической рекомбиназной амплификацией, которая подняла чувствительность до 2 аМ (аттомоль — 10−18 моль). Именно такая чувствительность необходима для многих практических задач, например, тестирования на ВИЧ. Кроме того, вторая версия SHERLOCK использует дополнительный CRISPR-ассоциированный фермент — нуклеазу Csm6. «С оригинальным SHERLOCK мы обнаруживали единственную молекулу в микролитре, но теперь мы можем достичь 100-кратного увеличения чувствительности, — говорит первый автор работы Омар Абудайе, аспирант Массачусетского технологического института в лаборатории Чжана (Институт Брода). — Это особенно важно для таких приложений, как обнаружение внеклеточной ДНК опухоли в образцах крови, где концентрация вашей мишени может быть чрезвычайно низкой».
Авторы рассчитывают, что их технологию можно будет применять для выявления мутаций в клетках млекопитающих перед генной терапией (а также после нее). Они уже провели серию опытов на человеческих клетках in vitro.
Реагенты, которые использовались в данной работе, доступны для академического сообщества через Addgene, а программное обеспечение — на сайте лаборатории Чжана и на GitHub.
Диагностический метод DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), который разработали Дженнифер Дудна с соавторами, также основан на CRISPR и по концепции весьма сходен с SHERLOCK. Статья о нем была впервые опубликована на bioRxiv.org в ноябре 2017 года, а 15 февраля 2018 года вышла в Science.
Здесь также используются Cas12a и ДНК-репортеры с флуоресцентной молекулой на одном конце и гасителем на другом. Фермент Cas12a разрезает не только молекулу-мишень, но и молекулы одноцепочечной ДНК, оказавшиеся поблизости. При этом репортер удаляется от гасителя, и возникает флуоресцентный сигнал. Как и Чжан с коллегами, авторы работы использовали изотермическую амплификацию для усиления сигнала, и тоже достигли аттомолярной чувствительности.
Принцип действия DETECTR (https://www.hhmi.org/news/crispr-based-technology-can-detect-viral-dna)
Тестировали метод совместно с доктором Джоэлем Палефски и его командой в Калифорнийском университете (Сан-Франциско). В образцах определяли ДНК-сигнатуры двух онкогенных папилломавирусов — ВПЧ 16 и 18. По данным ВОЗ, именно они вызывают 70% случаев рака шейки матки и предраковых поражений и при этом довольно широко распространены.
Исследователи взяли 25 образцов у людей, инфицированных обоими типами вируса, одним из двух или ни одним. В случае ВПЧ 16 ни одной ошибки DETECTR не сделал, анализ на ВПЧ 18 был верным в 23 из 25 образцов. Те, что он пропустил, давали слабый сигнал, который, вероятно, можно усилить, если скорректировать последовательность гидРНК, говорит Дудна.
Как отметил участник работы Лукас Харрингтон, аспирант лаборатории Дудны, по сравнению с существующими современными методами обнаружения папилломавирусов DETECTR «проще, быстрее и не требует специализированного оборудования». Это может сделать его привлекательным для медицинских учреждений с ограниченным финансированием. Метод легко адаптировать для поиска маркеров рака, хросомомных аномалий и т.п.
Таким образом фундаментальные исследования древней системы бактериального иммунитета нашли очередное практическое применение. CRISPR — «сундук с сокровищами, в котором мы продолжаем рыться, находя все новые вещи», — говорит Харрингтон.
Источники
Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Max J. Kellner, Julia Joung, James J. Collins, Feng Zhang. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 2018; eaaq0179 DOI: 10.1126/science.aaq0179
Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh et al. // Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. // Science 28 Apr 2017, Vol. 356, Issue 6336, pp. 438-442, DOI: 10.1126/science.aam9321
Janice S. Chen, Enbo Ma, Lucas B. Harrington et al. // CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. // Science. Published online February 15, 2018. DOI: 10.1126/science.aar6245
Публикация Дудны и соавт. на BioRxive
Показать все 0 комментария