Технология редактирования генома становится проще

Подготовил Илья Скляр

Один из самых важных элементов методики редактирования генома CRISPR-Cas9, — гидРНК (guide-RNA), обеспечивающая специфичность распознавания определенного участка генома. Однако синтез уникальной гидРНК — довольно трудоемкий этап эксперимента. Авторы статьи, опубликованной в Nature Communications, предлагают использовать гидРНК, комплементарную не к какому-то конкретному гену, а к таргетным сайтам связывания флиппазы (flippase recognition target sites, FRT). Эти сайты — стандартные последовательности в различных библиотеках мутантных бактерий, а также дрозофил. Они содержат 30—40 пар нуклеотидов, а флиппаза, узнающая эти таргетные сайты, действует как сайт-специфическая рекомбиназа, приводя к инсерции, делеции, инверсии или транслокации элемента посредством рекомбинации.

В качестве рабочей модели исследователи использовали коллекцию Keio штаммов кишечной палочки E.coli. В геноме каждого из штаммов этой коллекции нокаутирован тот или иной необязательный для жизнедеятельности клетки ген — он заменен канамициновой кассетой (конструкцией, которая дает клетке устойчивость к антибиотику канамицину), окруженной FRT-сайтами.

Свою методику ученые назвали CRISPR-FRT (см. рисунок из статьи). Нуклеаза Cas9, направляемая гидРНК к FRT, связывает и разрезает два FRT-сайта, фланкирующих канамициновую кассету. Поскольку E.coli не умеет соединять негомологичные концы ДНК, ей поможет выжить только рекомбинация. Для этого исследователи вместе с плазмидами, кодирующими гидРНК и Cas9, добавляют к клеткам амплифицированный фрагмент ДНК — интересующий их ген (как правило, тот самый, что был нокаутирован в штамме, но с той или иной мутацией), фланкированный гомологичными участками, которые делают возможной рекомбинацию. В результате CRISPR заменяет гены устойчивости к канамицину на мутированные гены. Полученные штаммы затем рассеивают в плашки с канамицином и без него: те, которые выживают на среде с канамицином, очевидно, смогли избежать гомологичной рекомбинации и встройки мутантного гена.

Авторы отмечают, что таким образом можно создать штамм с любой интересующей мутацией в любом гене, нокаут которого есть в коллекции, и предполагают, что аналогичным образом можно использовать не только FRT, но и другие подобные последовательности.

Источник

Toon Swings et al. // CRISPR-FRT targets shared sites in a knock-out collection for off-the-shelf genome editing// Nature Communications, 2018; 9 (1) DOI: 10.1038/s41467-018-04651-5