NGS-система для тех, кто потерпел вирусологическую неудачу

Беседовала Яна Войцеховская

Дмитрий, для чего нужна новая тест-система?

Для выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также для определения тропизма вируса. Однако с ее помощью можно не только обнаруживать конкретные мутации устойчивости, но и делать самую разнообразную науку.

Это все-таки больше научный тест или медицинский?

Набор HIV-resist-seq-NGS получил регистрационное удостоверение и только вышел на коммерческий рынок, так что пока мы не можем сказать, где он в большей степени найдет свое применение. Однако к нам уже обратилось два отечественных коллектива, которые собираются использовать его для выполнения научных задач, а также коллеги из Каролинского университета в Стокгольме, которые хотят применять его в медицинских целях, для рутинного определения лекарственной устойчивости. Они хотят переходить с сэнгеровского метода на NGS, потому что это более производительный и более информативный метод, и к тому же он становится более дешевым. Так что и с научной и с практической стороны есть интерес.

У вас также выпускается тест-система для ВИЧ на основе сэнгеровского секвенирования, чем от нее отличается тест-система на основе NGS и как она работает?

В них используются разные методы секвенирования — классическое сэнгеровское секвенирование в одной тест- системе («HIV-resist-seq») и NGS в другой («HIV-resist-seq-NGS»), и это влияет на точность, чувствительность и стоимость этих тестов, а также на производительность лаборатории.

Принцип работы NGS-теста следующий: из исследуемого образца проводят экстракцию нуклеиновых кислот, реакцию обратной транскрипции, амплификацию. Из полученных продуктов ПЦР готовят библиотеки для чтения их в NGS–секвенаторе. После секвенирования проводится анализ данных.

Технически анализ с помощью NGS от анализа с помощью классического секвенирования отличается только этапами подготовки библиотек и анализа данных. И, конечно, этапом секвенирования, который в обоих случаях выполняется в генетическом анализаторе без участия сотрудника лаборатории. Таким образом, именно превосходство метода секвенирования нового поколения при сравнении с классическим обуславливают преимущества новой тест-системы.

В каких случаях этот тест назначается пациенту?

В основном тест назначается в случаях, если у пациента обнаружена вирусологическая неудача. Обычно, когда ВИЧ-инфицированный пациент начинает принимать антиретровирусные препараты, они должны полностью подавить репликацию вируса в организме. Если все в порядке, то довольно быстро, через несколько месяцев, мы видим уменьшение концентрации вируса в крови (вирусной нагрузки) до недетектируемого уровня. Однако если у пациента был вирус с мутациями лекарственной устойчивости, либо если терапия назначена не оптимально, либо если пациент принимает препараты неправильно или не вовремя, то вирус снова может начать размножаться. Пациент будет принимать препараты, а вирусная нагрузка уменьшаться не будет, и терапия будет бесполезна.

Если врач это видит, то ему следует назначить тест на лекарственную устойчивость. К сожалению, сейчас врачи часто этого не делают и меняют терапию вслепую. На основании собственного опыта и общих рекомендаций врач решает, что если препараты A, B и C, которые принимает пациент, неэффективны, то он должен назначить им препараты D, E и F. Поскольку он не знает точный профиль лекарственной устойчивости вируса, то назначение препаратов «вслепую» может оказаться неточным, и эта неточность приведет к новым мутациям и неэффективности уже вновь назначенной схемы.

Некоторые мутации имеют перекрестную устойчивость, например, мутация, вызывающая устойчивость к препарату А, может приводить к слабой устойчивости к препарату D, и если назначить такой препарат, то через непродолжительное время уже и к препарату D возникнет высокая устойчивость.

Кроме того, каждая следующая схема терапии обычно более дорогостоящая, чем предыдущая. Если препараты первой линии антиретровирусной терапии стоят 30–60 тысяч рублей в год, то препараты второй линии могут стоить уже 100–150 тысяч рублей, а если и они станут неэффективными, то следующая схема может стоить и миллион.

В других случаях тесты могут использоваться в качестве надзорных, для изучения распространенности мутаций лекарственной устойчивости на территории РФ, да, в целом, на любой территории. Для этого проводят тестирование "наивных" пациентов, то есть, пациентов, еще не получавших терапии. Мы исследуем 200–300 таких пациентов, желательно, чтобы они были инфицированы недавно, секвенируем их вирусы и анализируем мутации. Конечно, у них мутации встречаются намного реже, но на основании анализа этих мутаций мы можем дать рекомендации врачам-клиницистам, какие препараты стоит использовать в составе первой линии терапии, а каких уже следует избегать, потому что есть риск возникновения неэффективности препарата.

К сожалению, с расширением масштаба приема терапии эта проблема первичной лекарственной устойчивости становится все более значительной. Десять лет назад в России АРВ-препараты принимали 30 тысяч человек, а в прошлом году — более 300 тысяч, люди действительно стали больше лечиться, и это хорошо. Цель ЮНЭЙДС (Объединенная программа ООН по ВИЧ/СПИД. — PCR.ru), ВОЗ, Минздрава, и я согласен с этой целью, — чтобы все ВИЧ-инфицированные принимали антиретровирусные препараты. А это значит, что в ближайшее время нас ждет еще более чем трехкратное увеличение охвата.

Но чем больше людей принимают препараты, тем больше возникает случаев лекарственной устойчивости, и тем чаще ВИЧ-инфицированные передают такие вирусы дальше. Так возникает замкнутый круг, и чтобы его избежать, тест на лекарственную устойчивость должен стать важной частью практического лечения.

Но может быть, тогда лучше вообще обойтись без терапии?

Терапия не только продлевает человеку жизнь, она также позволяет ему оставаться клинически здоровым. Если человек принимает препараты, он на протяжении длительного периода времени и чувствует себя хорошо, и внешне здоров. Если пациент не принимает препараты, то обычно через 5–7 лет после заражения у него начинают появляться различного рода оппортунистические инфекции, которые не дают ему возможность вести нормальный образ жизни.

Без терапии ВИЧ-инфицированный обычно живет 10–12 лет. Но если он вовремя начал принимать препараты и пьет их правильно, то продолжительность его жизни практически не отличается от продолжительности жизни неинфицированных людей.

Также терапия может рассматриваться как средство противодействия эпидемии, потому что человек, принимающий препараты, полностью подавляет вирус у себя в крови, в плазме, сперме и других жидкостях и тканях организма. Как результат, он значительно менее инфекционно опасен.

К сожалению, от 8 до 15 процентов ВИЧ-инфицированных, принимающих препараты, каждый год сталкиваются с вирусологическим неуспехом, и им нужен тест на лекарственную устойчивость. Сейчас во всей стране делается 5 тысяч таких исследований, а требуется в 5 раз больше. И в ближайшее время потребуется в 20 раз больше, если мы будем лечить всех ВИЧ-инфицированных, а это миллион человек.

Что должно быть в лаборатории, чтобы проводить такой анализ?

Она должна быть оснащена соответствующим оборудованием и расходными материалами для выполнения молекулярных исследований. Дополнительно в лаборатории должен присутствовать NGS-секвенатор. Существуют разные комплектации тест-системы. Наиболее полная форма комплектации адаптирована под MiSeq. Мы сделали это, во-первых, чтобы валидировать анализ от первого до последнего этапа. Во-вторых, MiSeq на сегодня самая распространенная платформа в России и, по мнению многих экспертов, является наиболее экономически выгодным, удобным и надежным NGS-секвенатором.

Также у нас есть более простая форма комплектации, она содержит реактивы для экстракции нуклеиновых кислот, для амплификации генома вируса и для регистрации этих результатов с помощью электрофореза. Затем пользователи должны самостоятельно готовить библиотеки из полученных ампликонов и секвенировать их с помощью любых секвенаторов. Мы уже проверили и убедились, что те же самые ампликоны, которые мы секвенировали на MiSeq, возможно проанализировать с помощью платформ Nanopore и Ion S5.

Запуская NGS-секвенирование, вы должны проводить анализ большого количества образцов, иначе цена каждого образца сильно вырастет?

Да, это так. В этом особенность данной тест-системы: к ней прилагается только один картридж для секвенирования, и она предназначена для исследования 48 пациентов одновременно. Если вы проанализируете 10 пациентов, то стоимость каждого анализа автоматически вырастет в пять раз. На самом деле, мощности картриджа хватает для одновременного анализа даже 480 образцов, но в данном случае мы ограничили количество для повышения запаса надежности: избыточная мощность секвенирования с лихвой окупает все возможные недостатки предыдущих этапов тестирования, например, этапа подготовки библиотек.

Можно сказать, что если лаборатория собирается исследовать более чем 200–300 образцов в год, то это уже достаточная загрузка, и ей стоит задуматься о переходе на NGS-секвенирование.

Насколько в целом сравнимы по цене сэнгеровская система и NGS?

Сэнгеровская тест-система стоит чуть дешевле тест-системы на основе NGS. Однако нужно учитывать, что она не включает довольно дорогие реагенты и расходные материалы для секвенатора: капилляры, полимер и так далее. Их цена приблизительная равна стоимости самой тест-системы. В то же время тест на основе NGS включает все расходные материалы, в том числи и картридж для MiSeq.

В вашей тест-системе при пробоподготовке используется большое количество циклов ПЦР. Как отличить ошибки ПЦР от реальных мутаций?

Мы всеми силами с "мокрой" стороны, со стороны реагентики, постарались уменьшить возможность ошибок. Мы использовали SuperScript компании Invitogen с высокоточной полимеразой на стадии обратной транскрипции, а на второй стадии амплификации мы использовали высокоточную полимеразу Q5.

Кроме того, наши биоинформатики разработали алгоритмы для выявления потенциальных ошибок, например, связанных с возникновением нетипичных нуклеотидов. Это не гарантирует стопроцентное отсутствие ошибок, однако при секвенировании стандартов мы показали, что итоговая точность исследования составляет 99.9%.

Это сравнимо с сэнгеровским секвенированием?

Это лучше, чем у сэнгеровского секвенирования.

Сэнгеровский тест может обнаружить варианты вируса, представленные в небольшом количестве — 10–20%. Как с этим у теста NGS?

NGS-метод позволяет обнаруживать даже 1% минорных вирусных вариантов.

Конкретно наш сэнгеровский тест HIV-resist-seq выявляет приблизительно 20% минорных вариантов с вероятностью 100%. Если представленность вирусной популяции понижается до 10%, то вероятность выявления такого вируса у сэнгера падает примерно до 50%.

Другими словами, если у ВИЧ-инфицированного пациента из 100 вирусных частиц 20 имеют какую-то мутацию лекарственной устойчивости, то сэнгер их выявит. Если только 10 частиц несут мутацию, то вероятность их выявления составляет уже 50%. А если представленность этих мутаций еще ниже, то, скорее всего, сэнгер это пропустит.

HIV-resist-seq-NGS выявляет 5% минорной популяции практически со стопроцентной вероятностью. Он также выявляет и 1%, но только при высоком покрытии. У нас разработан так называемый плавающий порог от 1 до 5%, который зависит от степени покрытия. Если библиотеки подготовлены качественно, и покрытие хорошее, больше 1000 чтений, то устанавливается однопроцентный порог и образец анализируется соответствующим образом. Однако если что-то пошло не так при амплификации или во время подготовки библиотек, то порог повышается. Использование «плавающего» порога позволяет нам сохранить высокую точность секвенирования.

Есть ли у тест-системы какое-то биоинформатическое сопровождение?

Да, конечно. Мы с самого начала понимали, что сами по себе «сырые» данные NGS по себе мало кому будут нужны, потому что в большинстве диагностических лабораторий отсутствуют биоинформатики. Поэтому тест-система включает программное обеспечение, выполняющее контроль качества полученных из секвенатора данных и анализ результатов.

Пока мы разрабатывали «мокрую» составляющую тест-системы, наши биоинформатики занимались алгоритмом анализа данных. В результате пользователь получает не только реагенты, но и компакт-диск с программным обеспечением и возможностью воспользоваться онлайн-сервисом. После окончания работы секвенатора пользователь просто нажимает одну кнопку, и все, — через 6-12 часов он получает результаты по каждому из 48 пациентов.

Есть ли аналоги этого теста в мире и в России?

В России аналогов нет ни для сэнгеровского, ни для NGS-теста. На основе сэнгеровского секвенирования в России сейчас используются два коммерческих набора — «АмплиСенс» и ViroSeq. Я знаю несколько отечественных коллективов, которые имеют собственные научные разработки для амплификации и секвенирования традиционным сэнгеровским методом, но это не коробочные тест-системы.

Что касается зарубежных стран, то в настоящее время существует две коммерческие тест-системы по секвенированию ВИЧ методом NGS. Однако они секвенируют определенный набор генов, наиболее интересных с точки зрения лекарственной устойчивости. Наша тест-система позволяет амплифицировать весь геном.

И за счет того, что это наша отечественная система, у нас все равно цена ниже. Например, только этап анализа полученных нуклеотидных последовательностей зарубежной тест-системы стоит 100 евро.

Есть ли аналогичные системы на основе NGS для других вирусов?

Та же самая компания, которая разработала NGS на ВИЧ, сделала аналогичный тест для гепатита С. Наверное, это все... В научных целях NGS сейчас используется для секвенирования огромного количества вирусов, здесь нет каких-то особых трудностей. Однако готовых тест-систем пока нет.

Какие у вас дальнейшие планы и мечты?

Планы и мечты — сделать этот анализ доступным. У нас стоимость терапии — 30–40 тысяч рублей, а в Африке, например, всего 75 долларов. Фармкомпании готовы идти на снижение стоимости препаратов в обмен на увеличение объемов продаж.

К сожалению, исследование лекарственной устойчивости в настоящее время является дорогостоящим продуктом. Стоимость теста для пациента варьирует от 10 до 15 тысяч рублей за отечественный тест. А если мы говорим о зарубежных тестах, то это более 20 тысяч. То есть, стоимость диагностики растет и становится сопоставимой со стоимостью лечения, и с этим необходимо бороться.

Второй аспект — это трудоемкость анализа. Несмотря на усилия производителей приборов для секвенирования сделать анализ более простым и быстрым, это пока не очень хорошо получается. В области ПЦР-диагностики пять лет назад произошла революция, и появились роботы, которые позволили автоматизировать всю процедуру исследования: выделение нуклеиновых кислот, проведение ПЦР и анализ результатов. В области ИФА-диагностики такая автоматизация произошла еще раньше. Оператор просто ставит пробирку в прибор, нажимает кнопку и через два часа получает итоговый результат. Я рассчитываю, что подобная революция произойдет и в области исследований методом секвенирования.

И это как раз задача для нашей научной группы. Это даже уже не мечты, а наши планы. У нас есть отличная база по созданию тест-систем и возможность провести адаптацию существующих на рынке роботов для выполнения различных этапов исследования. Мы создадим линейку роботов, и пользователю для проведения исследования нужно будет только переставлять пробирки из одного в другой. Я очень надеюсь, что в ближайшие несколько лет мы сделаем это, что позволит качественно упростить выполнение анализа лекарственной устойчивости ВИЧ и сделать его доступным для ВИЧ-инфицированных.

Это будет очередным прорывом в области молекулярной диагностики.

На фотографиях — группа разработки новых методов диагностики ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов.